臨床生物化學(xué)/先天性代謝缺陷病

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臨床生物化學(xué)

遺傳性疾病的生物化學(xué)與分子生物學(xué)診斷
- 常見遺傳性疾病的發(fā)生與基因診斷
  - 血紅蛋白分子病
  - 先天性代謝缺陷病
  - 診斷分子生物學(xué)在生化遺傳學(xué)實驗室的發(fā)展前景

苯丙酮尿癥（PKU）因患者尿中含大量苯丙酮酸而得名病因是患者肝缺乏苯丙氨酸羥化酶，使由食物攝入體內(nèi)的苯丙酮酸不能正常代謝為酪氨酸，導(dǎo)致血清中苯丙氨酸濃度升高，可高達50-100mg/dl（正常參考值為1-3mg/dl）。大量的苯丙氨酸使旁路代謝活躍，經(jīng)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用生成苯丙酮酸。

苯丙氨酸羥化酶是在肝細胞中合成的，即在肝細胞中專一表達而在胎兒的絨毛細胞或羊水細胞中并不表達，給PKU的產(chǎn)前診斷帶來了困難。

由于診斷分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，1983年胡流清等人完成了人苯丙氨酸羥化酶cDAN探針的制備。他們利用探針和Southern blot技術(shù)進行分子雜交，通過限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment-length polymerphism ，RFLP）分析實現(xiàn)了PKU的產(chǎn)前基因診斷。他們先用MSP-I限制性內(nèi)切酶消化正常人基因組 DNA，經(jīng)核酸電泳后，將DNA片段轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維膜（或尼龍膜）上，再用32p標(biāo)記的人苯丙氨酸羥化酶cDNA探針雜交后，再經(jīng)放射自顯影技術(shù)顯示正常人群有23kb和19kb兩種限制性片段長度。同時他們調(diào)查了一個PKU家系，進行比較發(fā)現(xiàn)，同樣用Msp-I內(nèi)切酶消化，父母同時有23kb和19kb DNA，患兒只有19kb片段。說明在該家系中，苯丙氨酸羥化酶突變基因是與19kb片段連鎖的。連鎖簡而言之就是指同一條染色體上的基因聯(lián)合遺傳的現(xiàn)象。因此在該家系中的第2胎，如果只出現(xiàn)19kb DNA片段將是患兒，而同時出現(xiàn)23kb和19kb DNA片段或只出現(xiàn)23kbDNA片段的都是正常個體，而且只出現(xiàn)23kb DNA片段者不攜帶突變基因，不是突變基因的攜帶者。正常人出現(xiàn)19kb僅代表蛋白質(zhì)和酶的多態(tài)。PKU家系的患兒為19kb，正常兒為23kb說明該PKU家系的基因突變與19kb連鎖。（表15-2）

表15-2　人苯丙氨酸羧化酶基因核酸電泳與cDNA探針雜交自顯影

正常人多態(tài)	PKU家系
			父	母	患兒	正常胚胎
23kb	-	-	-	-		-
19kb		-	-	-	-

1986年胡流清等進一步證明苯丙氨酸羧化酶的表達異常是基因點突變所致，并確定了突變點位置，并由此設(shè)計了正常和突變的各含21個核苷酸的寡核苷酸探針。

↓

正常探針5′TCCATTAACAGTAAGTAATTT3′

突變探針5′TCCATTAACAATAAGTAATTTT3′

↑

用這兩個探針分別與PKU家系成員的DNA雜交，證實與正常探針雜交者為正常個體，與突變探針雜交者為患者，同時可與兩個探針雜交者為正常個體，但攜帶突變基因。此法已成功用于產(chǎn)前診斷。（圖15-1）

正常與突變苯丙氨酸羥化酶探針與PKU家系成員的DNA雜交結(jié)果

圖15-1　正常與突變苯丙氨酸羥化酶探針與PKU家系成員的DNA雜交結(jié)果

雜交技術(shù)由于費時、操作復(fù)雜而難以在基層實驗室推廣?，F(xiàn)在多用聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增技術(shù)進行基因診斷，或在PCR基礎(chǔ)上再進行探針雜交，在提高靈敏度的同時又提高特異性，而且快速、經(jīng)濟、簡便實用。

（二）嘌呤代謝紊亂與痛風(fēng)

尿酸是嘌呤核苷酸分解代謝的重要產(chǎn)物，血和尿中尿酸濃度的檢測是嘌呤代謝紊亂的重要化學(xué)指標(biāo)。可由經(jīng)典的磷鎢酸還原法和高度特異的尿酸酶等化學(xué)方法檢測。

健康成年男子每天約生成尿酸600-700mg，其中60％-70％經(jīng)腎排出，剩余約200mg排入腸道由細菌降解。體內(nèi)尿酸池維持在1200mg尿酸水平。腎排出尿酸的機制是由于尿酸分子量?。?68u），可全部經(jīng)腎小球濾過，但至少有98％被近曲小管重吸收，再經(jīng)遠曲小管主動分泌，因此隨尿排出的尿酸主要由腎小管所分泌。腎每天約排出尿酸400-500mg（2.4-3.0mmol/L），相當(dāng)于腎小球原濾液中含尿酸的4％-5％。

在血漿pH為7.4時，尿酸幾乎完全以單鈉尿酸鹽的形式存在，溶解度有限，約為0.42mmol/L（7.0mg/dl）；而尿酸的溶解度更低，在pH5的尿液中，比尿酸難溶20倍。健康成年男子的血清尿酸濃度約0.3mmol/L，女子約低20％。血清尿酸水平隨年齡增加而增高，男性比女性更明顯，可達0.46mmol/L。血清尿酸超過0.42mmol/L為高尿酸血癥（hyperuricemia）。在血清尿酸濃度超過尿酸鹽的溶解度時，就有可能尿酸鈉的針狀結(jié)晶沉淀于關(guān)節(jié)、肌腱、韌帶、腎錐體的間質(zhì)組織等軟組織。足夠數(shù)量的尿酸鹽結(jié)晶可引起急性炎癥反應(yīng)，如沉積于關(guān)節(jié)腔，形成急性關(guān)節(jié)炎。這是由于尿酸鹽結(jié)晶被白細胞吞噬后，破壞溶酶體膜，使膜內(nèi)酶釋放損傷白細胞和周圍組織，引起關(guān)節(jié)炎癥狀。表現(xiàn)為關(guān)節(jié)劇烈疼痛，反復(fù)發(fā)作，此即痛風(fēng)（gout）。沉積于軟組織的結(jié)晶稱為痛風(fēng)石，周圍發(fā)生炎癥反應(yīng)則構(gòu)成痛風(fēng)結(jié)節(jié)。原發(fā)痛風(fēng)可由于遺傳所致的核苷酸代謝中某一種酶表達異常所致，繼發(fā)性痛風(fēng)則繼發(fā)于多種疾病。繼發(fā)性病因可能有大量服用葡萄糖、果糖與甘露糖，使體內(nèi)嘌呤合成增加；或多發(fā)性骨髓瘤、紅細胞增多癥、惡性貧血、牛皮癬和廣泛轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，使核蛋白轉(zhuǎn)換率增快，而尿酸生成過多；或細胞毒藥物或放射治療時，核酸分解亢進使尿酸鹽進一步增高。

先天性遺傳原發(fā)通風(fēng)病因是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）缺失所致，部分缺失時，臨床表現(xiàn)為尿酸過多的痛風(fēng)特征；當(dāng)完全缺失時，表現(xiàn)為高尿酸血癥、精神發(fā)育遲緩等特征的自毀容貌綜合征。

HGPRT蛋白質(zhì)分子為相同亞基的四聚體，每個亞基由217個氨基酸殘基組成。HG-PRT基因定位于X染色體長臂遠端，因此該病表現(xiàn)為X連鎖。HGPRT基因長約34kb，而成熟的mRNA的長度只有1.6kb，可見DNA分子內(nèi)含有大量的內(nèi)含子。HGPRT的突變基因及表達產(chǎn)物（mRNA，蛋白質(zhì)）已被分離、研究，和血紅蛋白一樣有許多突變類型，如有的109位絲氨酸被亮氨酸代替，有的103位絲氨酸被精氨酸代替，還有報告基因發(fā)生缺失、重排的嚴重發(fā)病患者。1983年Wilson等發(fā)現(xiàn)一例DNA上的TagI限制性內(nèi)切酶的切點發(fā)生突變，使在正常情況下可切出2.0kb片段的電泳區(qū)帶，由于切點突變而失去酶切作用，變成4.0kb的區(qū)帶出現(xiàn)。在蛋白質(zhì)水平進一步研究發(fā)現(xiàn)50位的精氨酸被甘氨酸取代。