臨床生物化學/核酸的分離與純化

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臨床生物化學

診斷分子生物學基本技術
- 分子生物學實驗基礎
  - 基因工程的常用工具
  - 目的基因
  - 基因庫的建立
  - 核酸的分離與純化
  - 探針制備

核酸存在于多種細胞，如病毒、細菌、寄生蟲、動植物細胞；多種標本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標本。因此分離方法復雜而多樣。又因各種DNA、RNA的豐度差異，各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異，因此在實驗前應對采用的方法有所了解和選擇。總的說來核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎上，利用苯酚等有機溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀，收獲。溶解細胞的方法因標本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白質變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，達到分離核酸的目的。實驗上生物標本中含量最多的就是蛋白質。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續步驟的酶促反應。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到純的DNA，用DNA酶除去DNA而獲得RNA。目前開發了許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用需分離核酸的特點與其特異性結合達到分離、回收的目的。

（一）質粒的分離與純化

含質粒的E. Coli cells經LB培養液250ml擴大培養，倒入50ml離心管，4℃，3000rpm，離心15分鐘。棄去上清液。（棄去液丟棄前應作消毒處理，以免污染環境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs2ml，蒸餾水30ml）上下搖勻，置冰水浴5分鐘。禁用混勻器，以免DNA分子斷裂），加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下搖勻，冰浴5分鐘。4℃，3000rpm，離心15分鐘。沉淀蛋白質。取上清液，加無水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室溫15分鐘后，10000rpm離心，棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE（10mmol/lTris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨。可用混勻器混勻，置冰浴10分鐘。4℃，10000rpm離心5min，棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/lTris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA緩沖液，1/10體積的5mg/ml RNase，37℃，30分鐘保溫。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml異戊醇)，混勻。4℃，10000rpm，離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復一次。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇，―20℃過夜或―70℃2小時以上。4℃，10000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加80％乙醇不搖動，直接10000rpm離心，棄上清液，真空干燥。加適量（約200μl）TE溶解。測定含量后備用。

（二）重組質粒中目的基因的分離與純化

先取少量純化的重組質粒，用限制性內切酶切出目的基因，經電泳分離，確認。以200μl含2mg DNA（重組質粒）為例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μgDNA加2-5U限制性內切酶，1/10體積緩沖液，1-2小時保溫。緩沖液種類和酶反應溫度因內切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無水乙醇，－70℃，2小時（－20℃過夜），10000rpm，10分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應分子量DNA標準同時電泳），在紫外光下觀察結果，與標準DNA分子量比較，確認目的基因和內切酶的切割效果。

⒈電泳條件：

凝膠制備：	1％瓊脂糖凝膠	agarose(mg)	X50TAE(ml)	EB(溴化乙錠μl)
	(agarose)	1000	2.0	4.0
	總體積（ml）
	100

膠濃度（％）：	0.3	0.6	0.7	0.9	1.2	1.5	2.0
DNA長度（kb）：	60-5	20-1	10-0.8	7-0.5	6-0.4	4-0.2	3-0.1
電泳緩沖液：	X50TAE(ml)	EB(μl)	總體積(ml)
	20	30	1000

X50TAE：Trismabase 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTApH8.0 20ml；蒸餾水至1000ml。

EB：10mg/mlethidium bromide。(EB有致癌性，操作應小心)。

經電泳確認后，取適量DNA（重組質粒）同上條件切開，用1.5％低熔點（＜65℃熔解）瓊脂糖凝膠，電泳分離。在紫外光下，切出含目的基因區帶（凝膠），放入離心管中，提取純化。

⒉從低熔點凝膠提取，純化DNA片段加與凝膠體積相等的TE（10mmol/lTris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結構分析，探針制備等）。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

（三）標本DNA的分離與純化

用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)調整細胞為2×10⁷個（組織應切碎置液氮冰凍，高速攪切成粉末后，加入緩沖液）。加1/10-1/20體積（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃2小時。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混勻（至少7分鐘）。4℃，3000rpm，10分鐘。取上清液，加2mlTE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混勻。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重復2-4步驟。測定含量。

（四）樣品RNA的分離，純化

含10⁶個細胞液加等量純化溶液［4mol/L胍基硫氰酸鹽，25mmol/L檸檬酸pH7.0，0.5％肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巰基乙醇］。總體積為細胞沉淀4-5倍，混勻。加0.1體積2ml/L乙酸鈉（pH4.1），1體積酚（重蒸水上封），0.2體積CIAA，混勻器劇烈混合10秒鐘。冰水浴15分鐘。10000xg4℃，20分鐘。離心（不用剎車）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），－20℃，60分鐘以上。10000xg，4℃，20分鐘離心。棄上清液。用1.5ml離心管約加0.3ml純化溶液，重復3)步驟，離心10分鐘，棄上清液。加75％乙醇，10000xg，4℃，10分鐘離心。棄上清液。真空干燥15分鐘，備用。