臨床生物化學(xué)/血漿蛋白質(zhì)的檢測及其臨床應(yīng)用
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血漿蛋白質(zhì)的檢測及其臨床應(yīng)用可以概括為以下幾方面：
1．定量地用化學(xué)方法測定血漿總蛋白質(zhì)以及白蛋白。
2．通過電泳將血漿（或血清）蛋白質(zhì)初步分離，可以半定量地檢測主要蛋白質(zhì)的組分及其圖譜，如Alb、α1、α2、β1、β2、γ等區(qū)帶，并以相對百分比表示之。
3 ．特異的定量測定個別蛋白質(zhì)，多采用免疫化學(xué)的技術(shù)，通過制備特異的抗血清（或抗體）測定抗原-抗體復(fù)合物。依據(jù)抗原抗體結(jié)合及其復(fù)合物的檢測手段可有濁度亮度法、沉淀法、免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法等。如果含量很微的蛋白質(zhì)則采用放射免疫測定法（RIA）及酶免疫測定法（EIA）。
此處僅從臨床的需要，對方法學(xué)的臨床應(yīng)用及其進(jìn)展作一簡介。
（一）血清總蛋白質(zhì)的測定
新鮮全血采取后經(jīng)自然凝固，析出血清，除去含量約為2-4μg/L的纖維蛋白原，剩下的即為血清蛋白質(zhì)。健康成人在活動狀態(tài)采血，其含量為63-83g/L，平臥休息時為60-78g/L。血漿總蛋白質(zhì)含量的變化不外兩大原因；一是血容量的改變（濃縮或稀釋）；二是個別蛋白質(zhì)組分的明顯增加或減少。血濃縮時的高血漿蛋白血癥，各個組分成比例的增加（病史中有失水史）。血稀釋時的低血漿蛋白血癥亦是相對的，各組分蛋白質(zhì)仍保持正常的比例。
由于個別蛋白質(zhì)的變化所致的低蛋白血癥，最多見的原因是低血漿白蛋白。輕度的高蛋白血癥可由于慢性感染性疾病引起的多克隆，彌散性的γ球蛋白增多癥是由于多發(fā)性骨髓瘤或異常蛋白血癥時單克隆免疫球蛋白增多。
應(yīng)當(dāng)指出，在進(jìn)行化學(xué)定量測定血漿蛋白質(zhì)時，我們作了如下假定：①所有血漿蛋白是純的多肽鏈（糖脂類和金屬有機物等均不計在內(nèi)），其含氮量平均為16%；②幾百種血漿蛋白其理化性質(zhì)雖不同，但與化學(xué)試劑作用產(chǎn)生的反應(yīng)（如呈色、沉淀）是一致的。顯然，這是過于理想化了的，事實上前一種情況是不存在的，后一種情況在不同蛋白質(zhì)之間也有很大的差別，因此采用任何一種化學(xué)方法作血漿蛋白質(zhì)的測定，嚴(yán)格來講都是從實用出發(fā)的，是相對的定量。
至今，凱氏定氮法仍然是建立各個具體方法時采用的參考標(biāo)準(zhǔn)方法。
雙縮脲比色法是目前首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法。方法操作簡便，雖然雙縮脲試劑有大同不異。其中酒石酸鉀納可以穩(wěn)定在堿性溶液中的銅離子，含有碘化物作為抗氧化劑。雙縮脲反應(yīng)生成的復(fù)合物其吸收峰為540nm。可采用公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)精確稱量，必要時用凱氏定氮法標(biāo)定。各地質(zhì)控中心提供的混合標(biāo)準(zhǔn)血清可作為第二參考，血清用量100μl，在10-120g/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，批內(nèi)CV值<2%，其它常用的方法還有：
1．基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法 由于各種蛋白質(zhì)分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達(dá)2%-3%，導(dǎo)致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2+，集中原法和雙縮脲反應(yīng)兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴于Cu2+。反應(yīng)產(chǎn)物最佳吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利于檢測較微量的蛋白質(zhì)。但試劑反應(yīng)仍易受多種化合物的干擾。
2．采用280nm和215/225紫外吸收值，計算蛋白質(zhì)含量 280nm 是由于蛋白質(zhì)分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和準(zhǔn)確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區(qū)200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區(qū)域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質(zhì)的影響。
3．采用沉淀反應(yīng)進(jìn)行散射比濁法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡便，不需特殊儀器，技術(shù)關(guān)鍵在于：①選擇最佳試劑濃度及溫度；②混勻技術(shù)；③選用的標(biāo)準(zhǔn)；④待測標(biāo)本中的蛋白濃度。
4．染料結(jié)合法 蛋白質(zhì)可與某些染料特異結(jié)合，如氨基黑（amino black）與考馬亮藍(lán)（comassive brilliant blue ）。這一性質(zhì)除了可以用于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶染色，亦可用于總蛋白質(zhì)的定量。缺點是多種蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力不一致。考馬亮藍(lán)在與蛋白質(zhì)結(jié)合后的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質(zhì)可用分光光度法來定量檢測。
關(guān)于用化學(xué)方法測定白蛋白，現(xiàn)多采用特異性的染料（BCG或BCP）結(jié)合法，已于第一節(jié)中介紹。
（二）血清蛋白質(zhì)的電泳分析
醋酸纖維薄膜（ACM）和瓊脂糖凝膠是目前最廣泛采用的兩類介質(zhì)。巴比妥緩沖液pH8.6，離子強度0.05，標(biāo)本用量3-5μl，標(biāo)準(zhǔn)電泳條件為CAM每厘米寬電流0.75mA，瓊脂糖約為每厘米寬10mA，電泳時間40-60分鐘，電泳前沿達(dá)6cm左右。雖然目前已開展和應(yīng)用不少個別蛋白質(zhì)的測定方法，但血漿蛋白質(zhì)電泳圖譜至今仍然是了解血漿蛋白質(zhì)全貌的有價值的方法，可用為初篩試驗，以提供較全面的信息。正常血清電泳后可以很好地分為5條區(qū)帶（Alb、α1、α2、β1、β2），新鮮標(biāo)本可以分出β帶（以C3成分為主）。由于各條區(qū)帶中各個蛋白質(zhì)組分的重疊、覆蓋（如CER常被α2MG及Hp所掩蓋），以及某些蛋白質(zhì)染色帶很淺（如脂蛋白和α1糖蛋白），可以用其它染色方法輔助。目前除了常使用的氨基黑和麗春紅染料外，還采用靈敏度更高的考馬亮藍(lán)。
用血清蛋白質(zhì)電泳測定各組分的含量，通常可采用各區(qū)帶的濃度百分比（%）或絕對濃度（g/L）表示之。
用醋酸纖維薄膜電泳測得正常小兒及成人血清蛋白質(zhì)的參考值可參見表2-7。
在疾病情況下血清蛋白質(zhì)可以出現(xiàn)多種變化。根據(jù)它們在血清蛋白質(zhì)電泳圖譜上的異常特征，不少學(xué)者曾試將其分為以下類型，參見表2-8及圖2-1。
表2-7 各年齡組血清蛋白質(zhì)電泳正常值（X±SD）范圍
| 年齡 | 總蛋白質(zhì)（g/L） | 蛋白質(zhì)各組分的濃度比（%） | ||||
| 白蛋白 | α1 | α2 | β | γ | ||
| 臍帶血 | 57 | 69.4 | 2.5 | 5.4 | 7.0 | 15.4 |
| ±12 | ±5.6 | ±1.0 | ±1.6 | ±2.4 | ±4.4 | |
| 新生兒 | 60 | 64．2 | 3．5 | 14．1 | 9．2 | 6．2 |
| ±12 | ±13.2 | ±3.6 | ±2.1 | ±2.4 | ±4.8 | |
| 1-5歲 | 68 | 65.2 | 3.1 | 11.2 | 10.2 | 10.4 |
| ±11 | ±7.8 | ±1.3 | ±2.7 | ±2.6 | ±5.5 | |
| 6-12歲 | 69 | 61.7 | 3.0 | 10.5 | 10.2 | 14.7 |
| ±14 | ±6.1 | ±1.8 | ±3.4 | ±2.0 | ±5.8 | |
| 成人△1 | 64 | 2.8 | 6.6 | 7.2 | 14.4 | |
| 45-78 | 0.8-6.2 | 3.4-12 | 4.8-14 | 7.0-25 | ||
| 2 | 64 | 2.8 | 5.9 | 9.8 | 17.5 | |
| 55-71 | 0.9-4.8 | 2.6-9.2 | 6.3-13.3 | 12.2-22.3 | ||
| 3 | 68.7 | 3.1 | 6.0 | 8.2 | 13.8 | |
| 53-76.6 | 1.3-5.0 | 2.7-9.9 | 5.5-14.9 | 8.8-21.3 | ||
| 4 | 62.2 | 4.2 | 6.6 | 10.2 | 17.33 | |
| 47-77 | 0.7-7.6 | 2.4-10.8 | 4-16.4 | 8.8-25.7 | ||
| 5 | 65.7 | 2.28 | 5.7 | 8.8 | 17.5 | |
| 58.8-72.7 | 0.7-3.8 | 3.6-7.8 | 6.3-11.3 | 12.3-22.7 | ||
△資料取自不同作者：①上海醫(yī)科大學(xué)n=50；②重慶醫(yī)科大學(xué)n=123；③同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)n=132；④蘇州醫(yī)學(xué)院n=100；⑤湖南醫(yī)科大學(xué)n=100
表2-8 異常血清蛋白質(zhì)電泳圖譜的分型及其特征
| 血清蛋白質(zhì)的圖譜類型 | 總蛋白質(zhì) | Alb | α1 | α2 | β | γ | ||
| 1.低蛋白血癥 | ↓↓ | ↓↓ | N↑ | N | ↓ | N↑ | ||
| 2.腎病型 | ↓↓ | ↓↓ | ↑ | ↑↑ | 不定 | |||
| 3.肝硬化型 | ↓N↑ | ↓↓ | N↓ | N↓ | β-γ↑（融合） | |||
| 4．急性炎癥或急性時相反應(yīng)癥 | N | ↓N | ↑ | ↑ | N | |||
| 5.慢性炎癥型 | ↓ | ↑ | ↑ | ↑ | ||||
| 6.彌漫性肝損害型 | ↓N | ↓↓ | ↑↓ | ↑ | ||||
| 7．彌漫寬γ球蛋白血癥型 | ↑ | ↓N | ↑↑ | |||||
| 8.M蛋白血癥型 | 在α-γ區(qū)帶中出現(xiàn)M蛋白峰-M區(qū)帶峰 | |||||||
| 9．高α2（β）-球蛋白血癥 | ↓ | ↑↑ | ↑ | |||||
| 10.妊娠型（高α型） | ↓N | ↓ | ↑ | ↑ | N | |||
| 11.蛋白質(zhì)缺陷型 | 個別區(qū)帶出現(xiàn)特征性缺乏 | |||||||
上述電泳圖譜分型有助于臨床疾病判斷的參考。在某些蛋白質(zhì)異常增多的情況下，可出現(xiàn)異常區(qū)帶。如高濃度的αFP可以在Alb與α1區(qū)帶間出現(xiàn)一條清晰的新帶（有人稱之為肝癌型）；CRP異常增高可出現(xiàn)特殊界限的γ區(qū)帶；單核細(xì)胞白血病可出現(xiàn)由于溶菌酶異常增多的γ后區(qū)帶等；單克隆免疫球蛋白異常癥（M蛋白血癥）則在α-γ區(qū)帶中出現(xiàn)一條很深的界限截然的M區(qū)帶。
在大劑量使用青霉素或水楊酸等藥物時，由于藥物與白蛋白的結(jié)合，可導(dǎo)致這部分白蛋白電泳遷移率的加快而出現(xiàn)區(qū)帶狀的改變。
急性時相反應(yīng)型常以α1及α2區(qū)帶加深為特征；妊娠型以α1區(qū)帶增高為特征，伴有β區(qū)帶的增高；以α2區(qū)帶增高為特征的圖譜常見于風(fēng)濕病等免疫反應(yīng)性疾病。其它慢性炎癥則同時有α1、α2及γ-球蛋白的增加。在肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化及慢性肝炎伴肝硬化可以出現(xiàn)β、γ區(qū)帶融合彌散的寬γ帶。慢性遷延型肝炎、慢性活動型肝炎及慢性反復(fù)感染可以出現(xiàn)多條γ區(qū)帶的加深。
（三）免疫化學(xué)法測定個別蛋白質(zhì)
散射比濁法和透射比濁法由于測定方法簡便、快速而被廣泛使用。許多試劑盒供應(yīng)抗血清及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，即可建立此測定法。此技術(shù)可以測定抗原-抗體復(fù)合物（沉淀顆粒）形成的量（終點法），亦可采用測定復(fù)合物形成的速率（動力學(xué)方法，即通過散射濁度計測定抗原-抗體混合反應(yīng)復(fù)合物顆粒形成的時間，即反應(yīng)速率。一定條件下，反應(yīng)速率與反應(yīng)體系中抗原的含量直線相關(guān)，可以通過制備標(biāo)準(zhǔn)曲線而計算）。
現(xiàn)已有設(shè)計完善的帶微電腦進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的散射濁度計和透射濁度計，以免疫化學(xué)系統(tǒng)（immuno-chemicalsystem,ICs ）可供應(yīng)。免疫擴(kuò)散法不需昂貴設(shè)備，放射免疫法則需要液體閃爍計數(shù)器及應(yīng)用放射性同位素。
現(xiàn)將幾種常用的免疫化學(xué)測定法的特點列表總結(jié)比較于表2-9、10中。
表2-9 電泳與免疫化學(xué)檢測血清蛋白列表比較
| 電泳法（CAM法） | 各種免疫化學(xué)分析法 |
| 前白蛋白 | 前白蛋白 |
| 白蛋白 | 白蛋白 |
| α1球蛋白（區(qū)帶） | α1抗胰蛋白酶 |
| α1酸性糖蛋白 | |
| α1脂球蛋白 | |
| α1脂蛋白 | |
| 甲狀腺激素結(jié)合球蛋白，皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白 | |
| α2球蛋白（區(qū)帶） | 結(jié)合珠蛋白 |
| α2巨球蛋白 | |
| 銅藍(lán)蛋白 | |
| 前β脂蛋白 | |
| β球蛋白（區(qū)帶） | 轉(zhuǎn)鐵蛋白 |
| 血紅素結(jié)合蛋白 | |
| 補體C-4，C3 | |
| β2微球蛋白 | |
| γ球蛋白（區(qū)帶） | IgG，A，M，D，E |
| C反應(yīng)球蛋白 |
表2-10 幾種免疫化學(xué)測定方法的比較
| 靈敏度 | 準(zhǔn)確性 | 檢測時間 |
| 散射比濁法 10mg/L | 批內(nèi)CV值<5% | 幾分鐘（動力學(xué)法） |
| 1小時 （終點法） | ||
| 透射比濁法 20-30mg/L | 批內(nèi)CV值5%-10% | 1小時內(nèi) |
| 免疫擴(kuò)散法 >20mg/L | 批間CV值5%-15% | 1-2天 |
| 放射免疫法 μg/L | 批內(nèi)CV值5%-10% | 幾小時 |
關(guān)于免疫化學(xué)測定方法中的標(biāo)準(zhǔn)品和方法的標(biāo)準(zhǔn)化問題：含有準(zhǔn)確含量的純抗原蛋白不易買到。制備的抗血清由于其來源不同，其特異性和靈敏度效價有很大差異，一個純蛋白制劑來制備高特異性的抗血清亦非輕易之舉。因此抗血清的制備和方法的標(biāo)準(zhǔn)化是方法推廣和使用的關(guān)鍵。據(jù)美國病理學(xué)會的研究報告，測α1AT用同一標(biāo)本，使用5種不同的方法在510個實驗室報告的結(jié)果從1.6-2.34g/L。同一研究中C3補體的測定采用了8種不同方法，測定結(jié)果為149-282mg/L。
世界衛(wèi)生組織目前提供以下參考標(biāo)準(zhǔn)品：IgG 、IgA、IgM、IgD、IgE、αFP、CEA、Alb、C3、CER及TRP。使用國際單位（IU），沒有使用絕對的質(zhì)量單位。美國疾病控制中心（CDC）供應(yīng)的國家參考標(biāo)準(zhǔn)品人血清蛋白質(zhì)含13種蛋白質(zhì)，亦使用WHO的國際單位標(biāo)明含量。
由于不易獲得穩(wěn)定的抗血清和標(biāo)準(zhǔn)化的參考蛋白質(zhì)，各個實驗室還不得不根據(jù)自己的條件建立自己的正常參考值。
 疾病時血漿蛋白質(zhì)變化的圖譜特征 | 細(xì)胞骨架蛋白——組織特異性蛋白的鑒定及其意義  |
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