醫學遺傳學/限制性片段長度多態性

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醫學遺傳學基礎

基因診斷
- 基因診斷的原理
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  - 限制性核酸內切酶
  - 限制性片段長度多態性

一個人的兩套單倍體 DNA是不完全相同的，一般每100－500個堿基對就有一個是不相同的。換言之，如果把兩套基因組DNA（各3.2×109bp）排列起來，那么平均有1000萬處不同，它們多位于內含子序列中。實際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。

DNA的多態性雖可通過DNA測序檢出，但用限制酶消化卻是最常用的檢測方法。

1．RFLP由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現差異（圖13-3），這種由于內切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態性（restriction fragmentlength polymporphism, RFLP）。RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法（見下節）檢出。用Southern雜交檢出RFLP時，如探針跨越切點，則被切開的兩個片段均可與探針雜交，從而顯示兩條雜交帶（圖13-4）。

RFLP示意圖箭頭酶切位點

圖13-3 RFLP示意圖箭頭酶切位點；

左圖：等位基因2由于出現新的切點，DNA片段縮至8kb;

右圖：DNA片段電泳后雜交圖

RFLP的檢出等位基因

13-4 RFLP的檢出等位基因1因有額外切點而導致產生

兩個長短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能與探針雜交

2．兩點RFLP

（1）點態（point polymorphism）：是由于單個或少數堿基的改變引起酶切點的出現或消失所致的RFLP。上述的RFLP即屬于這一類。它們屬經典的RFLP。在人類基因組中已發現數以百計的此類多態位點。

（2）數目變異的串連重復（variable number tandem repeats,VNTR）：上述經典的單個堿基取代所致的RFLP一般只能檢測到一種雜合性的兩種形式，即“有”或“無”某個限制酶切位點，而且每個位點在人群中的雜合子頻率通常不會超過50％，當被測個體為純合狀態時，利用RFLP就無法得到所需要的多態信息。此外，在整個基因組中，這類RFLP目前發現的數量還有限，并分布不勻。

但是，在人類基因組中還存在一類DNA重復序列，稱為小衛星DNA。它們分布十分廣泛，每一個單位通常只有16-28bp長，但其重復次數在人群中是高度變異的。當用限制酶切割VNTR區時，只要酶切點不在重復區內，就可能得到各種長度不同的片段（圖13-5）

與小衛星DNA不同，另一類重復序列是衛星DNA。它們的基本序列有1－6bp，如（TA）n、(CGG)n等，通常重復10-60次并呈高度的多態性。

VNTR導致的RFLP重復次數的變異致酶切位點的移動和DNA片段長度的變異